常见的病原微生物主要包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、立克次体等,几乎所有的病原微生物都含有核酸(脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA),是微生物的遗传物质。分子生物学检验技术正是以DNA或RNA为主要检测目标,通过检测基因的存在与否、是否发生缺陷、表达是否正常等来对体内病原微生物的状态进行精准的反映。
聚合酶链式反应(PCR)是目前应用广泛的分子生物学检测技术,以特定DNA片段为目标,通过特异性的引物,在聚合酶的作用下,经过变性、退火、延伸几十次的循环反应,达到对目标DNA的体外扩增和放大,再对扩增的产物进行鉴定和分析。根据对模板来源、扩大信号等的改进,PCR技术又衍生出多种方便快捷的检测方法,如RT-PCR(实时荧光定量PCR)、数字PCR等。PCR技术已在多种类型的微生物定性及定量检测中广泛应用,比如乙肝、丙肝、HIV等,定量结果对一些感染性疾病的用药及治疗也有一定的指导意义。疫情期间通常说的“核酸检测”就是应用PCR的手段对新冠病毒进行快速准确的检测,相较于抗原检测更加准确灵敏。
基因芯片技术是以大量的核酸探针(DNA探针或RNA探针)通过微阵列技术高密度的固定在芯片载体上,通过分子杂交,从而实现对目标基因的批量检测。根据探针种类不同,基因芯片可分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片两种,按照芯片的载体材料不同,可分为无机材料和有机材料;依据点样方式的不同可以分为原位合成芯片、微矩阵芯片、电定位芯片三种。芯片技术可用于基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析等,在细菌、病毒、真菌等微生物检测中均有应用。相较与PCR,芯片技术可以同时检测多种已知病原微生物。
高通量基因测序技术(NGS)是对核酸的碱基序列进行测序分析,无需对病原体进行分离培养,也不依赖已知核酸序列,可以同时获得整个菌群的基因组信息,对病原微生物毒力、耐药等均可进行分析。以微生物生态群落中所有微生物的基因组为研究对象的宏基因组学已在肠道菌群方面开展许多研究。此外,高通量测序对未知物种及难培养的病原微生物鉴定方面具有无可比拟的优势,对新冠病毒变种的鉴定就是依托高通量测序技术进行的。
PCR、微生物基因芯片、高通量测序等高灵敏度的分子生物技术,可以对微生物进行快速、定性、定量的检测和分析。理论上只要有一个病原微生物存在,分子生物学检测手段就可以精准检出,对于判断疾病是否处于隐性或亚临床状态有重要意义。基因芯片和NGS的费用较高,对场地、设备、人员的要求也较高,虽然在科学研究中已广泛应用,但在临床微生物检验方面尚未完全普及。
(彭慧芳 河南科技大学第一附属医院)